ポリアクリルアミドゲル電気泳動

ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、支持媒体としてポリアクリルアミドゲルを使用する、一般的に使用されている電気泳動技術です。オリゴヌクレオチドとタンパク質を分離するためによく使用されます。陰イオン系洗剤としてよく使用され、可溶化剤やテクスチャー付与剤としても機能します。濃縮ゲルの機能について語るときに、スタッキングの役割がよく言及されます。濃度が比較的低い場合、細孔サイズは比較的大きくなります。この点については以下で詳しく説明します。

導入

作用原理：ポリアクリルアミドゲルはネットワーク構造を持ち、分子ふるい効果を持ちます。ネイティブ PAGE と SDS-PAGE の 2 つの形式があります。ネイティブ PAGE では、タンパク質は電気泳動中にそのまま残り、タンパク質の分子量、形状、電荷に応じて徐々に勾配で分離されます。

SDS-PAGE は、サブユニットの分子量のみに基づいてタンパク質を分離できます。この技術は、1967 年にシャピロによって初めて確立されました。彼らは、イオン性洗剤と強力な還元剤 (SDS、ドデシル硫酸ナトリウム) をサンプル媒体とアクリルアミドゲルに加えた後、タンパク質サブユニットの電気泳動移動度は主にサブユニット分子量の大きさに依存することを発見しました (電荷係数は無視できます)。

効果

SDS は陰イオン性洗剤です。変性剤および可溶化剤として、分子内および分子間の水素結合を破壊し、分子を変性させ、タンパク質分子の二次構造および三次構造を破壊します。メルカプトエタノールやジチオトレイトールなどの強力な還元剤は、システイン残基間のジスルフィド結合を破壊することができます。サンプルとゲルに還元剤と SDS を加えると、分子はポリペプチド鎖に脱重合されます。脱重合されたアミノ酸側鎖は SDS と結合してタンパク質-SDS ミセルを形成します。それらが持つ負電荷はタンパク質の元の電荷を大幅に上回り、異なる分子間の電荷と構造の違いがなくなります。

SDS-PAGE では通常、不連続バッファー システムが使用されます。これは、連続バッファー システムに比べて高い解像度を実現できます。

濃縮ゲルの機能はスタッキングです。ゲルの濃度は低く、細孔径は大きいです。比較的希薄なサンプルを濃縮ゲルに加えると、大孔ゲルの移動効果により狭い領域に濃縮されます。サンプル溶液およびスタッキングゲルとして TRIS/HCl 緩衝液を選択した場合、電極溶液として TRIS/グリシンが選択されます。電気泳動が始まると、HCl は塩化物イオンに解離し、グリシンは少量のグリシンイオンに解離します。タンパク質は負に帯電しているため、塩化物イオンが最も速く動き、グリシンイオンが最も遅く動き、タンパク質が中間の位置で一緒に正極に向かって動きます。電気泳動の初期段階では、塩化物イオンの移動度が最も大きく、タンパク質の移動度を上回り、背面に低導電率領域が形成されます。電界強度は低導電率領域に反比例するため、より高い電界強度が生成され、タンパク質とグリシンイオンが急速に移動して安定した界面が形成され、タンパク質が移動界面付近で凝集して中間層に凝縮します。

この識別方法では、タンパク質の移動度は主にその相対的な分子量に依存し、その電荷や分子の形状とは関係ありません。