ウエスタンブロッティングの手順は何ですか?

ウエスタンブロッティングは、アメリカ人のジョージ・スタークによって初めて発明されたタンパク質検出技術です。電気泳動技術を用いて特定の組織や細胞からタンパク質を分離し、NC膜やPVDF膜に固定し、特定の抗体を用いて特定の抗原を検出します。この技術は病気の原因となる抗原を見つけることができるため、現在では病気の診断など多くの生物学分野で広く利用されています。豚足の作り方の手順を見てみましょう。

1. 原則

サザンブロット法やノーザンブロット法に似ていますが、ウエスタンブロット法ではポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用し、検出対象はタンパク質、「プローブ」は抗体、「展開」は標識された二次抗体です。 PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離されたタンパク質サンプルは、固相担体（ニトロセルロース膜など）に移され、固相担体は非共有結合の形でタンパク質を吸着し、電気泳動で分離されたポリペプチドの種類とその生物学的活性を変化させずに保持することができます。固相担体上のタンパク質またはポリペプチドを抗原として、対応する抗体と反応させ、次に酵素または同位体で標識された第2の抗体と反応させ、基質発色またはラジオオートグラフィーによって検出します。

2. 分類

ウエスタンブロットの開発にはいくつかの主な方法があります。

i. オートラジオグラフィー

ii. 基質化学発光ECL

iii. 基質蛍光ECF

iv. DAB基質発色

一般的に使用される方法は、基質化学発光 ECL と基質 DAB 比色法です。最初の方法は、同じレベルと実験条件で使用され、公開された論文では通常、基質化学発光 ECL が使用されています。既製のテストキットを購入するだけで、操作は比較的簡単です。原理は次のとおりです（二次抗体はHRPで標識されています）：反応基質は過酸化物+ルミノールです。HRPに遭遇すると、光を発し、フィルムを露出させてバンドを洗い流すことができます。電気泳動により分離された特定の標的遺伝子によって発現されたタンパク質成分を測定します。この技術はタンパク質レベルの検出にも広く使用されています。

3. サンプルの準備

1. 単層接着細胞からの総タンパク質の抽出：

2. 組織からの総タンパク質の抽出：

3. 薬剤処理した接着細胞からの総タンパク質の抽出。

ウエスタンブロッティングは、遺伝子の誤発現によって引き起こされる疾患を特定する方法です。病気の原因となる抗原を素早く見つけ、特定の抗体（タンパク質）を染色できるという利点は、遺伝病、遺伝的問題、病気の検出の研究に広く利用されています。その生産に基づいて、サザンブロットハイブリダイゼーション法などの新しい検出技術も開発されています。